Huis > Nieuws > Nieuws uit de sector

Drie expressiesystemen van recombinant eiwit

Update tijd : 2021-02-03

Bron:

Keer bekeken : 26

Drie expressiesystemen van recombinant eiwit
Recombinante expressie van eiwit verwijst naar het klonen van het vreemde gen in een expressievector die een specifieke promotor bevat en het mogelijk maken dat het tot overexpressie wordt gebracht in E. coli onder de inductie van IPTG. Verschillende eiwitten zijn geschikt voor verschillende expressiesystemen, waaronder voornamelijk expressievectoren, gastheerstammen en inductieomstandigheden.

Keuze van expressievector:


De keuze van de expressievector voor het fusie-eiwit wordt beperkt door vele factoren. Allereerst moet er een geschikte meervoudige kloneringssite op de vector zijn. Ten tweede is het noodzakelijk om de juiste fusielabel te selecteren op basis van de daaropvolgende voorwaarden voor eiwitzuivering.


De meest gebruikte fusietags zijn His.Tag, GST.Tag, Nus.Tag en Trx.Tag. Onder hen is de His-tag relatief klein en heeft deze geen duidelijke invloed op de structurele eigenschappen van het eiwit.

Na zuivering op basis van affiniteitschromatografie is verwijdering van de tag niet vereist; een iets grotere tag zoals GST moet in het volgende proces echter met een specifiek enzym worden verwijderd. In veel praktische toepassingen is het vaak wenselijk om een oplosbaar actief eiwit tot expressie te brengen.

De oplosbaarheid van een specifiek doeleiwit is afhankelijk van veel factoren, waaronder de vector. De drager met GST.Tag kan de oplosbaarheid van het fusie-eiwit verhogen.


Selectie van gastheerstam:


De expressiestatus van hetzelfde eiwit in verschillende gastheren kan verschillen. De hosts uit de BL21-serie worden momenteel het meest gebruikt. De Rosetta-gastheerstam afgeleid van BL21 kan de expressie van eukaryote eiwitten versterken met zeldzame codons van E. coli.

Deze stam vormt een aanvulling op de tRNA's van codons AUA, AGG, AGA, CUA, CCC en GGA via een compatibel chlooramfenicol-resistent plasmide. Op deze manier zorgt de Rosetta-stam voor een "universele" vertaling, waardoor expressiebeperkingen worden vermeden vanwege de frequentie van het gebruik van E. coli-codon. De BL21 (DE3) -gastheer vergemakkelijkt de vorming van inclusielichamen.


Inductie voorwaarden:


Veranderingen in inductiecondities hebben ook invloed op de eiwitexpressie. Over het algemeen zijn oplosbare eiwitten het meest nodig in praktische toepassingen, waarbij de meest geschikte inductietemperatuur moet worden gevonden.

Het aandeel oplosbare proteïne dat door de meeste proteïnen wordt gesynthetiseerd onder lage temperatuur (15 ~ 25 ℃) gedurende de nacht zal relatief groot zijn.


Bovendien heeft de concentratie van de inductor ook een effect op de expressietoestand van het eiwit, en een lage concentratie van de inductor is gunstig voor de expressie van oplosbaar eiwit. Hogere temperaturen kunnen de snelheid van eiwitsynthese, de snelheid van het vouwen van tussenproducten om aggregaten te vormen, en de hydrofobe interactiekracht verhogen.


Het tot expressie gebrachte eiwit bestaat waarschijnlijk in de vorm van inclusielichaampjes. De hogere concentratie inductor (0,8-10 mM IPTG) kan ook de vorming van inclusielichamen in de bacteriën bevorderen. Voor pET-recombinanten met gewone T7-promoters kan IPTG met een eindconcentratie van 0,5 mM volledig worden geïnduceerd, terwijl vectoren met T7lac-promoters IPTG met een eindconcentratie van 0,8 mM nodig hebben om volledig te worden geïnduceerd.


In sommige DE3-gastheerbacteriën kan het niveau van eiwitexpressie worden gewijzigd door de concentratie van IPTG aan te passen. Over het algemeen wordt een kleine hoeveelheid testinductie uitgevoerd vóór de grootschalige expressie van het eiwit om de optimale IPTG-concentratie en de optimale inductietemperatuur te bepalen om het doeleiwit de beste activiteit en oplosbaarheid te laten bereiken.

Voor meer specifieke inductieoperaties, zie Generalbiosystems —— de laatste artikelupdate van het recombinant proteïne-expressiebedrijf.