Huis > Nieuws > Nieuws uit de sector

E. coli-expressiesysteemtypen

Update tijd : 2021-02-03

Bron:

Keer bekeken : 26

E. coli-expressiesysteemtypen
Het E. coli-expressiesysteem is het meest gebruikte eiwitexpressiesysteem. Ongeveer 30% van de recombinante eiwitproducten op de markt wordt geproduceerd door het E. coli-systeem. Het E. coli-expressiesysteem van Generalbiosystems kent grofweg drie soorten expressie.

1. T7 E. coli-expressie


T7 E. coli brengt het doelgen op een hoger niveau tot expressie. Maar als het doelgen giftig is voor E. coli, zal het de celgroei beïnvloeden. T7 E. coli-expressie is een expressiesysteem dat is geconstrueerd met T7-promoter en T7-faagtranscriptiesysteemelementen. T7 RNA-polymerase is een zeer actieve RNA-polymerase.

De synthesesnelheid van mRNA is vijf keer die van het RNA-polymerase in E. coli. Sommige sequenties die niet kunnen worden getranscribeerd door E. coli RNA-polymerase, kunnen ook worden getranscribeerd. Daarom kunnen T7-RNA-polymerase en T7 in aanwezigheid van de faagpromotor het transcriptiesysteem van E. coli zelf niet concurreren met het T7-faagtranscriptiesysteem, en uiteindelijk regelt de T7-faagpromotor de eiwittranscriptie.


2. Lac en Tac E. coli expressiesysteem


Lac en Tac Escherichia coli expressiesysteem is een expressiesysteem ontworpen en geconstrueerd op basis van het regulatiemechanisme van Escherichia coli lac operon. Het schellakoperon heeft een polycistronische structuur. Bij afwezigheid van een inductor bindt het lacI-genproduct van de negatieve regulerende factor zich stevig aan de operator stroomafwaarts van de promotor en begint het weefseltranscriptie.


In aanwezigheid van de inductor IPTG, na binding aan de repressor, wordt het vermogen om aan het operon te binden verminderd en gedissocieerd, waardoor de transcriptie van het lac operon wordt geactiveerd. Het expressiesysteem geconstrueerd met de tac-promotor wordt het Tac-expressiesysteem genoemd.


Om de Lac- en Tac-expressiesystemen strikt te reguleren, wordt een mutant lacIq van het lacI-gen dat overmatig lacI-repressoreiwit kan produceren op het expressiesysteem aangebracht. Toen de expressievector echter werd geconstrueerd met behulp van replicons met een hoge kopie, werd nog steeds een hoger niveau van achtergrondtranscriptie waargenomen en werd het lacIq-gen in de expressievector geïnsereerd om meer lacI-repressoreiwitproductie te garanderen.


3. PL en PR E. coli expressiesysteem


Het systeem geconstrueerd met de vroege transcriptiepromotors PL en PR van lambda-faag als de kern wordt PL en PR E. coli expressiesysteem genoemd. Promotors PL en PR hebben een sterk vermogen om transcriptie te initiëren.

Het gebruik ervan om expressievectoren te construeren is voorgesteld en bestudeerd in de vroege ontwikkeling van E. coli expressiesysteem. Dit expressiesysteem is gebaseerd op het genproduct van de temperatuurgevoelige mutant cl857 om de transcriptie van de PL- en PR-promoters te reguleren.

Het genproduct komt in actieve vorm voor bij een lagere temperatuur (30 ° C), en verliest bij een hogere temperatuur (42 ° C). leven. Deze expressievector is vrij onstabiel in gewone E. coli, die wordt veroorzaakt door de krachtige directe transcriptie van de PL- of PR-promotor zonder het cl-genproduct in de bacteriën.


Een manier om dit probleem op te lossen is om lysogene lambda-faag Escherichia coli te gebruiken als de gastheerbacterie voor PL- en PR-promoter-expressievectoren; de tweede manier is om het cI857ts-gen op de expressievector te monteren, zodat het groter kan zijn. Het bereik van gastheerbacteriën om uit te kiezen.


Aangezien de PL- en PR-expressiesystemen geen chemische inductoren hoeven toe te voegen tijdens inductie en de kosten laag zijn, gebruiken de eerste paar medicinale recombinante eiwitten die in het E. coli-systeem worden bereid, dit expressiesysteem allemaal. Het heeft echter ook zijn eigen tekortkomingen.


Allereerst wordt tijdens het warmtestimulatieproces de expressie van E. coli heat shock-eiwit ook geactiveerd, inclusief proteolytische enzymen, zodat het tot expressie gebrachte recombinante eiwit kan worden afgebroken.

Ten tweede is het bij grootschalige fermentatie en kweek van bacteriën relatief langzaam om de kweektemperatuur te verhogen van 30 ° C naar 42 ° C. Dit soort verwarmingsmethode kan het inductie-effect en de expressie van recombinant eiwit beïnvloeden.


Neem voor expressievereisten voor E. coli contact op met Generalbiosystems —— proteïne-expressiebedrijf.